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本格的なメタゲノム解析による口内のフローラ（常在菌）の菌叢解析
  • 真菌の解析も可能
  • 動物の解析も可能（要打ち合わせ）
  • ​次世代シーケンスデータの解析のみも対応
研究用には２つのサービスがあります

  • ​一般・歯科医院向けにサービスを行っているCOMAに統計解析・サンプル間比較などを加えた解析の　COMA Pro light

  • 本格的な解析を行うCOMA Pro

​の２種類です

COMAシリーズの違い
▶COMA
　（一般・歯科医院向けサービス）
coma一般.png

COMAは、一般・歯科医院向けサービスは、細菌の種類をHOMDデータベースを基準に、ヒトの口腔内で検出されるだろうと推測される、655菌種に限定しました。

655菌種の内、71菌種は歯周病、リスク疾患などの表現型と結びついていて、それぞれの菌の占有率とリスク度を表示しています。

​パイチャートは菌を機能別にグループ化した見やすいパイチャートを表示いている定形レポートです。

COMA詳細はこちら
COMAスペックはこちら
▶COMA Pro light
　（研究向けサービス）
Prolight概要.png

COMA Pro lightは。研究向けサービスで、COMAの655菌種のデータベースを利用し、定形レポートに加え、COMA Proで実施する各種統計解析を加えたサービスです。

ヒトの口腔内では200〜400種類の細菌が常在菌として検出されていますので、通常の常在菌の変化を見るには目的が達成できるのではないかと考えたサービスです。

まれな細菌の検出や動物試験には利用できません。

▶COMA Pro
　（研究向けサービス）
pro概要.png

ここで紹介している本格的な解析サービスです。

​まれな細菌の検出や動物試験にも利用できます。​

COMAの定形レポートはオプションとなります。

口内フローラ分析は、プロバイオティクス、プレバイオテクス、医薬品の開発や効果の検証など、などさまざまな目的で利用されています

  • 口腔内に常在するバクテリアと肌の状態、健康や疾患の関係は、まだまだ解明されていない点も多々ありますが、ある程度の疾患リスクなどの知見も多く見られています。口内フローラ分析は、様々な健康状態を特定着目菌株や多様性でモニターできると考えています。

  • ​ケア用品、サプリメント利用ののBefore/After、かぶれの原因菌の究明と対策方法の研究開発、医薬品の研究開発などさまざまな目的で利用できます。

  • 今後、口内フローラに着目したいので基礎データを収集したい

  • 生活環境に口内フローラがどのように関係するのかを知りたい

  • 歯周病の人が持つ有名勢以外の菌を見たい

  • Vivoでの実験は終了しているが、Vitro試験での効果を見てみたい

  • ケア用品やサプリメント、治療薬の効果としてBefore/Afterを知りたい

  • 免疫研究など行ないたい

  • 創薬に利用したい

  • ​動物での試験に利用したい

検体採取には専用の採取キットを準備し、１サンプルから受け入れています
  • 唾液収集キット
  • ペーパーポイントキットを準備しています。
  • ​動物試験用の綿棒
解析概要
解析の概要

  • データ解析は、NCBI Microbial16s を用いた約16000種類の菌データベースを用いた解析を実施します。

  • データ解析や統計処理は目的に合わせた手法を利用させていただきます。

  • 解析には当社が開発したMetagenome@Kinのソフトウエアを利用し、種レベルでの解析を基本とさせていただきます。詳しくは、Metagenome@Kinを参照してください。

  • ご要望により、html形式で見ることができるMetagenome@Kinの解析結果、Blast結果なども返却できます。

​シーケンス

16S rRNAメタゲノムシーケンスを実施します。プライマーは16S rRNA遺伝子のValiant領域を上手くカバーする設計です。

実験協力

データ処理
Proflow.png

Species（種）レベルでの解析を基本としています

​

  • NCBI, 16s Microbial データベースを利用

  • シーケンスデータの前処理とQCフィルターで不良シーケンスの除去

  • ​菌種特定はBlastによる相同性検索法を利用

  • Species（種）レベルから最上位階層であるBacteriaレベルまでのSun Burstグラフによる視覚化

  • サンプルごとの棒グラフで分布を視覚化

  • 主成分分析と視覚化

  • 常在菌の多様性分析と視覚化

  • 階層型クラスタリング

  • 自己組織化マップの作成

  • 表現型と菌種との有意差検定（多検体の場合）

  • ​群間​（サンプル間）比較（多検体の場合）

​ざまざまなオプション解析を準備しています。
真菌（ITS領域）の解析、定量PCR、高度な統計、比較解析など
# 実験オプション

  • 真菌のシーケンス

  • 総菌量の測定

  • ​その他ご相談ください

# 定量PCR : 以下の細菌は定量PCR解析が可能です

  • P.gingivalis

  • T.forsythia

  • T.denticola

  • P.intermedia

  • F.nucleatum

# データ解析オプション

  • ​真菌（ITS領域）の菌種同定と菌叢解析

  • 他の測定器データとの相関解析

  • 菌のアノテーション調査

  • ​菌の阻害物質、代謝物質の調査

  • タンパク質、化合物の相互作用調査

  • ​その他、ご相談ください

基本解析例
基本解析例

お打ち合わせ内容にもよりますが、以下のような視覚化などMetagenome@Kinの標準出力機能のレポートはいつでもお申し付けください。

全階層の視覚化表示 (Sun Burst Graph）

「Domain」から「Species」(一番外から2番目）までの微生物の分類階層で、サンプルごとのドーナッツグラフ作成します。（一番外側がStrain)

微生物のランクは以下の表の様になっていて、Species（種）レベルでと上位のGenus（属）レベルでの分類の違いを簡単に見ることができます。

P.gingivalis菌を例に取ると、Genusレベル(Porphyromonas属）ではその下の階層（Species以下)では207種類の微生物が分類されています。Speciesレベルでも137にも分類されます。そのうちのひとつが、Porphyromonas gingivalisとなります。

coma_sunburst.png

この図の例は、実際に検出された、Treponema属とその下の主な菌を示しています。本データは治療前のデータですが、治療後にはTreponema putidumが消滅しています

サンプルごとの棒グラフで分布を視覚化 (Bar Graph）

​サンプルを並べ、視覚化することで表現型によっての違いが明らかに見えることもあります。

coma_bar.png
主成分分析による視覚化と要素となる細菌の決定

  • 主成分分析の結果をプロット図として出力します(2D, 3D)

  • サンプル間で変動の大きい（＝分散が大きい）菌から主成分を設定し、サンプルの特徴として用いることで集団の形成を観察します。

  • 歯周炎治療前のサンプルと治療後のサンプル間で主成分分析のプロット位置が大きく二つに分かれた例です。

  • 各成分の要素となる細菌のリストが提案できます。

coma2dpca.png
クラスタリングと自己組織化マップによる検体と細菌の相関の算出と視覚化

階層型クラスタリング、自己組織化マップ（SOM)、PCoAなどを準備しています。詳細はご相談ください。

クラスタリングでは様々な条件を設定し、菌占有率の高い（赤色表示）サンプルと菌の関係を大雑把に観察することが出来ます。

ckuster.png

自己組織化マップで治療前後を考察すると、歯周炎治療前のサンプルが集まるクラスターではFilifactorやTreponemaがみられます。

som.png
多様性分析(Diversity）とパイチャートによる視覚化

​多様性の視覚化

多様性指数として、Simpson's IndexとShannon Entropyを利用しています。

Before/Afterや表現型グループなどの群ごとに多様性指数を算出します。

diversity1.png
pie_diversity.png

Simpson's Indexも0.8377から0.8703と多様性も高くなっている

（注意：治療前、治療後の円グラフの色は各サンプリングごとに検出されたトップ10の菌種を表示している為、同菌種が同色で表示されているわけではありません。）

ここまでの具体例で使用したデータについて

公共データベースDDBJで公開されているアクセッションERP001440: Periodontitis(歯周炎)患者のプラークに由来する16s rRNA アンプリコンIonTorrentシーケンスデータの４人分の治療前と治療後のシーケンスデータ（計8Fastqファイル）を利用して、メタゲノム解析を実施しました。

リード数＝30万リード/sample程度　

16s rRNAのV6領域を314 chipで読み取り

ERP001440.png
多検体でーたで必ず行われる解析
有意差検定・群間比較

Before/Afterや各種背景情報の違いによって分けられた検体群の細菌の占有率を利用して、群間比較や有意差検定を実施しています。

​打ち合わせ時に決定して、結果はExcelでの返却となります。

お見積りからレポートまでの流れ
coma_pro_flow2.png
お打ち合わせ

目的などご相談ください。

​経験に基づき、最適な実験計画をご提案します。

発注

ペーパーポイント、もしくは唾液の採取キット、動物試験では綿棒など準備しています。

  • １サンプルから受け入れていますので、どんなものかを見たいときもご利用いただけます。

採取した検体の返送

キット同梱の封筒を利用するか、クール便で送付してください。

お打ち合わせ時に提案をさせていただきます。

解析レポートの返却

お打ち合わせ時の内容に従って解析レポートを作成します。

​検体到着後、解析内容にもよりますが、約１ヶ月程度頂いております。

発注の流れ
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